細菌がどの遺伝子に頼って環境を生き抜くのかを調べるには、多数のトランスポゾン変異株を混合培養し、各株の増減をNGSで一括測定するTnSeq法^（注3）が有用ですが、PCR増幅の偏りで定量精度が損なわれるという問題がありました。
  東北大学大学院生命科学研究科の大坪嘉行客員研究員、永田裕二教授らの研究グループは、トランスポゾン変異株ライブラリーを新規開発のUMIタグ高効率連結法(図1)を用いてより高い定量性で解析するUMI-TnSeq法^（注4）を確立しました。
  また解読データからシーケンスライブラリー中のUMIタグ総数を推定する数学的手法を開発しました。タグ総数が推定できれば、解読量の十分さを示す指標値（検出完全度）^（注5）を計算できます。さらに、本手法をPCB分解菌に適用し、ビフェニル存在下での適応度が高まる変異を同定しました。
  本成果は2026年10月30日、国際学術誌DNA Researchに掲載されました。

 

 

【詳細な説明】
研究の背景
   細菌は土壌や水圏に広く生息し、物質循環や有害化学物質の分解を担っています。こうした細菌が、どの遺伝子を使って特定の環境を生き抜いているのかを明らかにすることは、環境浄化や物質生産への応用に直結します。この目的で広く使われているのが、トランスポゾン^（注6）をゲノムの各所に無作為に挿入して多数の変異株を作り、それらを混合培養して各株の増減をNGSで一括測定するTnSeq法です。増えた株の変異部位を調べれば、その環境で適応度を高める変異が分かります。
   NGSによる解析には定量精度の問題がつきまといます。多くの場合NGSの解析の前にPCR増幅が行われますが、増幅のされやすさは配列によって異なりまた運の要因もあるので、読み取られた回数がそのまま元のDNA分子数を反映しません。そこで、PCR増幅前にDNA分子ごとに異なる塩基配列（UMIタグ）を付加し、リードの本数ではなくタグの種類数で数えることで定量性を向上させる方法が用いられています。
   しかしTnSeq法においてはUMIタグをDNAに効率よく連結することは技術的に困難でした。またNGSリードを得た際に、リードの読み取り数が十分であるかどうかを評価する良い方法がありませんでした。

 

今回の取り組み
   研究グループは、UMIタグの総数を推定する数学的手法を開発しました。試料中にn種類のタグがあり、そこからm回の読み取りを無作為に行ったとすると、ちょうどx回読まれるタグの種類数は理論的に計算できます。実測された分布とこの理論分布との差が最小になるnを計算的に探索することで、一度も読まれなかったタグまで含めた総数を推定できます。研究グループはこの値をN推定値と名付け、実際に検出されたタグ数をN推定値で割った値を検出完全度と定義しました。N推定値が低ければタグの連結効率が悪く試料の多様性が不足していること、検出完全度が低ければ解読量が不足していることが分かります。
   この手法の信頼性を、4,190万リードの実測データを用いて検証しました。全データでは328万種類のUMIタグが検出されましたが、そのうち1%（42万リード）だけを用いた場合でも286万種類と推定でき、これは全データでの検出数の87%に相当します。少ない解読量からでもタグの総数をおおよそ把握できることが示されました（図2）。
   研究グループはまた、これまでに開発してきたUMIタグ連結法を本解析に適用しました。この方法は、逆転写酵素が二本鎖DNAの3'末端にグアニンを付加する能力と、形成したグアニン突出末端に相補鎖の合成を伴って任意のDNA配列を取り込ませる反応を利用するもので、UMIを含む1本鎖DNAを高い効率でDNA末端に連結できます（図1）。このUMI連結方法では、従来の制限酵素MmeIを用いた方法と比べてトランスポゾンが挿入された位置に隣接するゲノム配列を長く取得できるため、トランスポゾン挿入位置特定能が大きく向上します。
   これらを統合したUMI-TnSeqを、PCB分解菌Acidovorax sp. KKS102から作製した約12,500株の変異株ライブラリに適用し、ビフェニルを含む栄養培地と含まない培地で繰り返し継代しました。その結果、ビフェニル存在下で相対存在比が有意に増加する11か所の挿入位置を同定しました。最も増加が大きかったのは、ABC型安息香酸輸送体の遺伝子群の発現を上昇させる挿入で227.9倍、次いでrelA遺伝子を破壊する挿入が27.4〜136.0倍でした。安息香酸はビフェニル分解の中間代謝産物であり、菌体外に漏れ出た安息香酸を再び取り込む仕組みが、ビフェニル存在下での増殖に重要であることが示唆されます。

 

今後の展開
   N推定値と検出完全度は、TnSeq法に限らず、UMIを利用するあらゆる解析に適用できる汎用的な指標です。研究グループは、これらがメタゲノム解析や1細胞解析など幅広い分野で、データの品質と解読量の十分性を判断する基準として役立つと考えています。
   また研究グループは、変異によって適応度が上がる遺伝子を手がかりに細菌の環境適応を理解する考え方を「GIIF（Gene Identification based on Increased Fitness）」と名付け、既存のIVET法、STM法に次ぐ第三の方法論として提唱しました。適応度を高める変異を一つの細菌株に集約導入すれば細菌の能力を飛躍的に強化できると考えられ、環境浄化、排水処理、プロバイオティクス、農業といった応用分野への展開が期待されます。

 

 

_{図2. 解読量とUMIタグ数の関係。横軸は全解読データに対する使用割合、縦軸はUMIタグの種類数を示す。青は実際に検出された種類数、橙は本研究の方法で推定した総数（N推定値）。解読量が1%でも推定値はほぼ一定の値に収束している。}

 

【謝辞】
本研究は、日本学術振興会科学研究費助成事業（課題番号15H04471、17H03781、19H02865、22K19124、22H02233、24K21829）および公益財団法人発酵研究所の研究助成（K-2016-004）の支援により行われました。

 

 

【用語説明】
注1.    次世代シーケンサー：DNAの塩基配列を同時並行で大量に解読する装置。1回の運転で数千万本以上の配列を読み取ることができる。
注2.    UMIタグ（Unique Molecular Identifier、分子識別子）：増幅前の個々のDNA分子に付加する、分子ごとに異なる短い塩基配列。読み取り回数ではなくタグの種類数を数えることで、PCR増幅による偏りの影響を受けずに元の分子数を計数することができる。
注3.    TnSeq法：トランスポゾンを無作為に挿入した多数の変異株を混合培養し、各株の増減をNGSで一括して測定する手法。
注4.    UMI-TnSeq：UMIタグを利用して定量精度を高めたTnSeq法。
注5.    検出完全度（Detection Completeness Value、DCV）：実際に検出されたUMIタグの種類数を、本研究で開発したN推定値で割った値。1に近いほど解読量が十分であることを示す。
注6.    トランスポゾン：ゲノム上を移動する性質をもつDNA断片。遺伝学では、ゲノムの各所に無作為に挿入して遺伝子を破壊する、変異導入の道具として用いられる。

 

 

【論文情報】
タイトル：Estimating UMI-Tag count: UMI-TnSeq protocol for identifying fitness-relevant genes in the PCB degrader Acidovorax sp. KKS102
著者：Yoshiyuki Ohtsubo*, Yutarou Hemmi, Shiho Abe, Shouta Nonoyama, Kouhei Kishida, Yuji Nagata
*責任著者：東北大学大学院生命科学研究科 客員研究員 大坪嘉行
掲載誌：DNA Research
DOI：10.1093/dnares/dsag017
URL：https://doi.org/10.1093/dnares/dsag017