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ジスルフィド結合導入酵素によるたんぱく質の立体構造形成促進機構を解明 ~構造異常たんぱく質が引き起こす神経変性疾患などの原因解明に光~

ジスルフィド結合導入酵素によるたんぱく質の立体構造形成促進機構を解明 ~構造異常たんぱく質が引き起こす神経変性疾患などの原因解明に光~

2019.04.16 09:00

発表のポイント

  • 高速原子間力顕微鏡を用いた観察により、ジスルフィド結合導入酵素プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)が、構造未成熟な基質を捕獲する様子を可視化することに世界で初めて成功した。
  • 高速原子間力顕微鏡により捉えたPDIの動きが、たんぱく質の効率的な立体構造形成促進に重要であることを明らかにした。
  • PDIの基質認識機構および立体構造形成促進機構に対する理解が深まったことにより、構造異常たんぱく質が引き起こす種々の疾病の成因解明につながると期待される。

概要

 東北大学 学際科学フロンティア研究所の奥村正樹助教、東北大学 多元物質科学研究所の稲葉謙次教授(生命科学研究科、大学院理学研究科化学専攻 兼任)、熊本大学 発生医学研究所の小椋光教授、野井健太郎博士(現 大阪大学 ナノサイエンスデザイン教育研究センター 特任助教)らの研究グループは、JST戦略的創造研究推進事業において、高速原子間力顕微鏡注1)により、ジスルフィド結合注2)導入酵素プロテインジスルフィドイソメラーゼ(PDI)が構造未成熟な基質を捕獲する様子を可視化することに世界で初めて成功し、同酵素によるたんぱく質の立体構造形成促進機構に関する全く新しい概念を提唱しました。
 細胞内には、たんぱく質高次構造の形成反応を促進する仕組みがあります。特に構造未成熟なたんぱく質の構造修復の仕組みは、我々の生体内で不良たんぱく質の蓄積を防ぐために必要不可欠です。しかしながら、いまだどのようにして細胞内の補助因子が構造未成熟なたんぱく質を認識し、構造修復のため働いているのかよくわかっていませんでした。
 PDIファミリーたんぱく質注3)の1つであるPDIは、哺乳動物細胞の小胞体注4)内で、立体構造形成前のたんぱく質にジスルフィド結合を導入させたり誤って形成されたジスルフィド結合を修復したりなどの機能を担っています。PDIの結晶構造注5)は4つのドメインから構成されるU字構造であり、動きに富むことが示唆されていましたが、この動きがPDIの機能発現にどう関わるか解明されていませんでした。
 そこで、高速原子間力顕微鏡による1分子レベルでの観察により、PDIが酸化還元状態依存的にドメインの動きを制御していることを明らかにしました。さらに、BPTI、RNaseA、ラミニン、プラスミノーゲンといった形や大きさ、ジスルフィド結合の数が異なるさまざまな基質を還元変性させた状態で添加すると、PDIは二量体へ会合し、その中央に形成される空間(キャビティ)に基質が取り込まれる様子を観察することに世界で初めて成功しました。これにより、PDIが触媒するたんぱく質の酸化的フォールディング注6)の全く新しいモデルを提唱するに至りました。
 本研究成果は、2019年4月15日16時(英国時間)に「Nature Chemical Biology」のオンライン速報版で公開されました。
 

研究の背景

 小胞体は分泌たんぱく質や膜たんぱく質が合成される細胞内小器官であり、そこにはジスルフィド結合形成を促進する酵素やたんぱく質の凝集を抑制する分子シャペロン注7)などが存在します。ジスルフィド結合の形成、組み換えは高次構造を獲得するために必須であり、ジスルフィド結合形成が不可欠なたんぱく質には生物学的、医学的にも重要なインスリン、免疫グロブリン、血液凝固因子などが知られています。
 一方で、ジスルフィド結合は誤ったシステイン間で形成されることもあります。そのような結合はたんぱく質の構造異常を誘起するため、小胞体内にはジスルフィド結合の修復システムが備えられています。不良たんぱく質の蓄積は神経変性疾患注8)や糖尿病などを引き起こすと考えられるため、構造未成熟な不良たんぱく質の構造修復の仕組みは、我々の生体内において極めて重要な役割を担っています。
 そのため、哺乳動物細胞の小胞体中にはジスルフィド結合の形成を触媒する酵素として20種類以上ものPDIファミリーたんぱく質が存在し、たんぱく質の品質管理を行っています。特にPDIは、PDIファミリーたんぱく質の中でも最も研究が進んでおり、誤って形成されたジスルフィド結合を修復し、正しい酸化的フォールディングを促進する能力に長けています。しかし、大きさやジスルフィド結合の数が多様なたんぱく質に対して、PDIがどのように認識し、はたらきかけるのか、その作用機序はこれまで不明でした。
 

研究の内容と成果

 当研究グループでは、高速原子間力顕微鏡(高速AFM)という手法により、PDIが酸化還元状態依存的に4つのドメインで構成されるU字構造の開閉を制御し、この構造制御がさまざまな基質の効率的な酸化的フォールディングの触媒に重要な役割をもつことを明らかにしました。さらに、BPTI、RNaseA、 ラミニン、プラスミノーゲンといった形や大きさ、ジスルフィド結合の数が異なるさまざまな基質を還元変性させた状態で添加すると、PDIが二量体化することを発見しました(図1、図2)。立体構造形成前の基質はPDI二量体の中央に形成される空洞に取り込まれ、そこで迅速なジスルフィド結合の導入と構造形成を受けることを明らかにしました。
 この現象は、大きさやジスルフィド結合の数が異なる複数種類の基質に対しても同様に観察されることがわかりました。また、変性状態にある基質依存的に形成されたPDI二量体は基質のフォールディング状態(どの程度、立体構造形成が進んでいるか)や構造形成し易さ(フォールディング速度)に応じて寿命や形状を変えることを突き止めました。このように、二量体を形成することで生じる中央の空洞中に変性基質を捕獲し、効率的な酸化的フォールディングを促すというPDIの全く新しい触媒機構を提唱しました(図3)。

 

今後の展開

 パーキンソン病やアルツハイマー病など種々の神経変性疾患は体内で構造異常たんぱく質が過剰に蓄積することで引き起こされることが知られています。これまでにPDIの変異や機能欠損を引き起こす化学修飾が、さまざまな神経変性疾患の患者から見つかっています。今回新たにPDIの動的性質や二量体形成が、サイズやジスルフィド結合の数が異なるさまざまなたんぱく質のジスルフィド結合を効率的に導入する上で重要な役割を果たすことを明らかにしました。
 以上の基礎的知見は、生体内における高効率・高精度なたんぱく質の構造形成促進の触媒機構の新たな解明につながり、神経変性疾患や2型糖尿病などのフォールディング病に関する有用な情報を提供するものと期待されます。

 
 
 
図1 PDIの二量体形成
(上図)構造未成熟な基質を添加するとPDIは二量体を形成し、基質の立体構造形成に応じて単量体へと解離する。PDI二量体を拡大すると空洞が生じていることがわかる。
(下図)この空間に基質が取り込まれる様子。この中央の空洞が、基質の酸化的フォールディングの触媒に重要な役割を果たす。
 
 
 
図2 基質のフォールディング状態に応じたPDIの二量体形成
還元変性した基質を添加するとPDIは約60%まで二量体を形成するが、基質のフォールディング反応が進行するとPDIは単量体となる。二量体化したPDIが還元変性した基質に迅速にジスルフィド結合を導入することも、本研究により示された。

 
図3 PDIの新たな酸化的フォールディング触媒メカニズム
PDIが促進する酸化的フォールディング機構では、まず酸化型PDIが構造の開閉を利用して変性状態の基質を効率よく捕獲する。これに伴い、PDIは二量体を形成し、その中央に形成される空洞内で基質の酸化的フォールディングが効率的に進行する。基質のフォールディング状態や速度に応じてPDI二量体が寿命や形状を変えることで、さまざまな基質に対し、立体構造形成の促進および修復を行うことが示された。PDIが基質にジスルフィド結合を導入すると、自身の活性部位は還元状態になる。還元型のPDIはEro1と呼ばれる酸化酵素によって速やかに再酸化される。PDIとEro1は酵母からヒトまで高度に保存されている。
 
 
 
【用語解説】
注1) 高速原子間力顕微鏡(高速AFM)
基板に固定した分子を、先が極めて細い針で触れながら高速に走査することで、分子の形状と動きを一分子レベルでリアルタイムに観測するナノテクノロジー。
 
注2)ジスルフィド結合
近接する2つのシステイン残基のチオール官能基(-SH)が酸化され、硫黄原子間で架橋される共有結合。たんぱく質の立体構造形成を安定化する役割がある。
 
注3)PDIファミリーたんぱく質
ジスルフィド結合の形成、組み換え、開裂を担う小胞体中に存在する酵素群のこと。ヒト細胞の小胞体中では20種類以上のPDIファミリーたんぱく質が存在する。
 
注4)小胞体
細胞内小器官の1つであり、分泌たんぱく質が合成される。この区画で、分泌たんぱく質は酵素依存的に糖鎖修飾やジスルフィド結合形成を受ける。
 
注5)結晶構造
X線結晶構造解析と呼ばれる手法によって決定される分子構造。多くの場合は高分解能であり、原子レベルで分子構造を決定することができる。
 
注6)酸化的フォールディング
 ジスルフィド結合形成と共役して、たんぱく質の立体構造が形成される反応のこと。インスリンや免疫グロブリンなど医学的にも重要な多くのたんぱく質も、このプロセスを経て、立体構造および生理機能を獲得する。
 
 
【論文情報】
タイトル:Dynamic assembly of protein disulfide isomerase in catalysis of oxidative folding
(酸化的フォールディング触媒におけるPDIの動的会合機構の解明)
著者名:Masaki Okumura, Kentaro Noi, Shingo Kanemura, Misaki Kinoshita, Tomohide Saio, Yu-ichi Inoue, Takaaki Hikima, Shuji Akiyama, Teru Ogura, and Kenji Inaba
掲載誌:Nature Chemical Biology, UK
DOI:10.1038/s41589-019-0268-8
 
 
 
 
 
 
 
【問い合わせ先】
<研究に関すること>
稲葉 謙次(イナバ ケンジ)
東北大学 多元物質科学研究所 教授
〒980-8577 宮城県仙台市青葉区片平2丁目1-1
Tel:022-217-5604
E-mail:kinaba(at)tagen.tohoku.ac.jp
 
<報道に関すること>
東北大学 多元物質科学研究所 広報情報室
伊藤 智恵(イトウ トモエ)
〒980-8577 宮城県仙台市青葉区片平2丁目1-1
Tel: 022-217-5866
E-mail: soumu(at)tagen.tohoku.ac.jp